东北农业大学本科实验课程教育纲要 实验课称号 基因工程制药实验 实验课英文称号 Vaccinology Comprehensive Experiments 一、 理论课程（或实验课程） 课号： 09610043z 适用 专业： 制药工程 理论课程总学时： 72 实验总学时（ 周学时）： 4 学分： 1.5 开出实验个数：（ 验证实验 0 个； 归纳实验 2 个； 规划实验 1 个； 立异性实验 1 个） 应开实验学期： 第 5 学期 二、 实验课程简介 现代生物技能是当期影响国民经济的四大科学支柱之一， 而以基因工程药物为中心的医药生物技能则是生物技能范畴中最为活泼、 开展最为敏捷的部分。 基因工程药物是指运用 基因工程技能研发和生...

　　东北农业大学本科实验课程教育纲要 实验课称号 基因工程制药实验 实验课英文称号 Vaccinology Comprehensive Experiments 一、 理论课程（或实验课程） 课号： 09610043z 适用 专业： 制药工程 理论课程总学时： 72 实验总学时（ 周学时）： 4 学分： 1.5 开出实验个数：（ 验证实验 0 个； 归纳实验 2 个； 规划实验 1 个； 立异性实验 1 个） 应开实验学期： 第 5 学期 二、 实验课程简介 现代生物技能是当期影响国民经济的四大科学支柱之一， 而以基因工程药物为中心的医药生物技能则是生物技能范畴中最为活泼、 开展最为敏捷的部分。 基因工程药物是指运用 基因工程技能研发和出产药物， 首要包含蛋白多 肽药物、 反义核苷酸、 DNA 药物和基因工程抗体等等。 基因工程制药学实验是将基因工程制药的理论与实践融为一体并付诸实践的重要课程。 本课程涵盖了 从基因重组， 克隆和表达的规划与构建， 到基因工程菌的培育以及基因产品的别离纯化及剖析进程， 及终究的生物学活性点评。 三、 实验教育方针及根本要求 要求学生有激烈的事业心， 酷爱制药工程专业， 理论和实践相结合， 更深化的了解和把握基因工程药物的工程原理与技能。 1． 经过实验教育加强学生对基因工程药物的根本概念、 制作原理、 实验操作技能的了解与把握。 2． 经过实验教育使学生了解和把握出产蛋白多肽所用仪器的各种参数、 适用范围以及运用方法。 3． 经过实验教育培育学生的着手才能， 加强学生实验技能的练习， 培育学生运用所学的理论知识处理出产实践中所遇到的实践问题。 四、 教材及首要参考书 [1] 《生物技能制药》 张林生 主编， 出版社： 科学出版社。（2008年榜首版） . [2] 《.现代生物制药工艺学》 齐香君主编， 出版社： 化学工业出版社。（2004年榜首版.） [3] 《CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY》 Frederick M.. Ausubel主编.，出版社： John Wily Sons, Inc。（2006年.榜首版） [4] 《生物技能制药》 李德山 主编， 出版社： 东北农业大学。（2007榜首版） [5] 《基因工程药物》 李元 主编， 出版社： 化学工业出版社。（2007第二版.） 五、 考核方法 操作技巧， 出勤率， 实验情绪， 实验报告。 纲要主撰人： 李德山 榜首部分 基因克隆 （一） 动物安排 RNA的提取 1． 实验特色 实验类型 ： 归纳 实验类别 ： 专业 方案 学时： 4 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 把握的准则和要求， 了解 RNA 的提取的制备进程。 写出 实验报告， 叙说RNA 的提取的准则与要害并附成果。 3． 首要仪器设备 序号 1 高速冷冻离心机 2 高压湿热灭菌器 3 温箱 4 电泳仪 5 电泳槽 6 制冰机 7 提篮式液氮罐 8 凝胶成像体系 首要仪器设备称号 类型标准 Beckman 国产 DHG-9240A 国产 国产 国产 数量 1 1 1 1 6 1 4． 实验内 容概要 实验进程： 用 液氮研磨肝脏， 使肝脏细胞破碎。 氯仿可除掉杂蛋白， 异丙醇可对 RNA 进行抽提， 75%乙醇可脱去 RNA 中的盐类， 对其进一步纯化。 5． 实验操作要害 整个操作要带口 罩及一次性手套， 并尽可能在冰上操作。 并且整个操作要快速进行。 6． 留意事项 Trizol 有毒， 要留意防护。 （二） RT-PCR意图基因扩增 1． 实验特色 实验类型 ： 归纳 实验类别 ： 专业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 学习 并把握 RT-PCR 法基因扩增的进程和要害。 写出实验报告， 记叙 RT-PCR法基因扩增进程和操作方法。 3． 首要仪器设备 序号 1 水浴锅 2 高压湿热灭菌器 3 PCR仪 4 制冰机 5 电泳仪 6 电泳槽 7 凝胶成像体系 首要仪器设备称号 类型标准 国产 YXQ-WF22DS-K 数量 2 1 1 1 1 6 国产 国产 国产 国产 4． 实验内 容概要 将提取到的 mRNA 作为模板， 参加引 物， dNTP， 反转录酶。 然后反转录出cDNA。 对反转录出的在特定引 物存鄙人进行 PCR， 然后得到很多的扩增产品， 及暨咱们的目 的基因。 5． 实验操作要害 整个操作要带口 罩及一次性手套， 6． 留意事项 留意避免外界污染。 （三） 意图片断与载体的衔接 1． 实验特色 实验类型： 归纳 实验类别： 专业根底 方案学时： 4 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 把握质粒提取， 核酸的酶切衔接、 PCR 纯化及收回的操作根本进程。 写出实验报告， 简述上述操作要害。 3． 首要仪器设备 序号 1 水浴锅 2 高压湿热灭菌器 3 摇床 4 离心机 5 电泳仪 6 电泳槽 7 凝胶成像体系 首要仪器设备称号 类型标准 国产 YXQ-WF22DS-K 国产 国产 国产 国产 数量 2 1 1 6 1 3 4． 实验内 容概要 将目 的片 断（ PCR 产品） 及载体质粒用 相应的限制性酶切开成粘性结尾，经过胶收回纯化产品， 并在衔接酶的效果 下将两者连为重组质粒。 5． 实验操作要害 1、 质粒和刺进片 断纯度要好 2、 操控酶切和衔接时刻 3、 刺进片 断与载体之间的份额要操控好 6． 留意事项 避免污染， 留意紫外防护。 （四） 感受态细胞的制备和转化 1． 实验特色 实验类型 ： 归纳 实验类别 ： 专业 方案 学时： 4 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 把握感受态细胞制备和转化进程。 写出实验报告， 简述感受态制备和转化的进程与要害。 3． 首要仪器设备 序号 1 超净工作台 2 高压湿热灭菌器 3 大容量低温离心机 4 制冰机 5 摇床 5 水浴锅 4． 实验内 容概要 首要仪器设备称号 类型标准 SW-CJ YXQ-WF22DS-K 国产 国产 国产 数量 2 1 1 1 1 1 用 钙离子将大肠杆菌的细胞壁变脆， 经过热激法将外源质粒转入细胞中， 依托抗性基因挑选阳性细胞。 5． 实验操作要害 1、 菌体的成长状况 6． 留意事项 无菌操作， 防治污染。 （五） 阳性菌株的挑选和判定 1． 实验特色 实验类型 ： 归纳 实验类别 ： 专业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 把握阳性菌株的挑选和判定的方法。 写出实验报告， 简述改进程的要害。 3． 首要仪器设备 序号 首要仪器设备称号 类型标准 数量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 超净工作台 高压湿热灭菌器 温箱 水浴锅 离心机 摇床 PCR仪 电泳仪 电泳槽 凝胶成像体系 SW-CJ系列 YXQ-WF22DS-K DHG-9240A 国产 国产 国产 国产 国产 国产 2 1 1 2 6 1 1 1 6 4． 实验内 容概要 1、 菌株扩展培育 2、 质粒提取 3、 PCR 和酶切判定 5． 实验操作要害 1、 避免污染 第二部分 蛋白的表达纯化 （一） 蛋白表达条件优化 1． 实验特色 实验类型 ： 规划 实验类别 ： 专业 方案 学时： 6 每组人数： 5 开日 期： 2． 实验目 的与要求 了 解蛋白表达的必要条件和优化进程， 写出实验报告， 简述不同条件下蛋白表达改变。 3． 首要仪器设备 序号 首要仪器设备称号 1 超净工作台 2 高压湿热灭菌器 3 温箱 4 摇床 5 控温摇床 6 超声波破碎仪 7 电泳仪 8 笔直板电泳槽 9 电磁炉 10 低温层析柜 11 电动移液器 类型标准 SW-CJ系列 YXQ-WF22DS-K DHG-9240A 国产 国产 国产 国产 国产 数量 2 1 1 1 1 1 1 2 1 4． 实验内 容概要 调查不同诱导条件（ IPTG 浓度， 诱导温度及时刻） 下， 目 的蛋白表达量及表达状况的改变。 5． 实验操作要害 1、 IPTG 浓度的改变 2、 低温培育和常温培育的比照 3、 诱导时刻长短的比照 4、 培育方法（ 剧烈或温文） 的比照 6． 留意事项 各实验组要留意平行， 避免人为差错。 （二） 交融蛋白的纯化 1． 实验特色 实验类型 ： 归纳 实验类别 ： 专业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 了 解 AKATA 体系原理， 把握运用 该体系纯化蛋白的方法。 3． 首要仪器设备 序号 1 AKA TA 2 电泳仪 3 笔直板电泳槽 4 控温摇床 5 紫外检测仪 6 蠕动泵 7 电动移液器 8 低温层析柜 首要仪器设备称号 类型标准 SW-CJ 数量 1 1 2 国产 国产 4． 实验内 容概要 运用 AKATA 体系纯化交融蛋白。 5． 实验操作要害 1、 上样压力不能过大 6． 留意事项 留意仪器保护 （ 三） 蛋白润饰和热源检测 1． 实验特色 实验类型 ： 创 新 实验类别 ： 专业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 了 解蛋白标签的去除方法， 及了 解热源检测法点评蛋白纯度。 3． 首要仪器设备 序号 1 AKA TA 2 电泳仪 3 笔直板电泳槽 4 电子体温计 5 水浴锅 6 紫外检测仪 7 蠕动泵 8 低温层析柜 首要仪器设备称号 类型标准 SW-CJ 数量 1 1 2 1 1 国产 国产 国产 4． 实验内 容概要 运用 SUMO 蛋白酶去掉交融蛋白上的蛋白标签， 并运用 AKATA 体系纯化终究的目 的蛋白。 经过打针兔子调查产品中热源状况， 点评终究产品是否能够运用 。 5． 实验操作要害 1、 蛋白切开时刻 2、 血液打针蛋白 3、 检测打针后兔子的体温 6． 留意事项 留意避免被动物咬伤 留意仪器保护 第三部分 蛋白的生物学功用点评 （一） 糖尿病动物模型的制备 1． 实验特色 实 验类型 ： 创 新 实 验类别 ： 专 业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 为了 测定表达的蛋白的生物学功用， 需求制备动物模型来检测。 把握糖尿病性动物模型制备的方法和原理及点评方法。 3． 首要仪器设备 序号 1 超净工作台 2 老鼠养殖箱 3 纯水仪 4 血糖仪 首要仪器设备称号 类型标准 SW-CJ系列 国产 国产 数量 2 6 1 1 4． 实验内 容概要 STZ 可有用损坏胰脏安排， 打针 STZ 后， 小鼠 7 天内 呈现血糖升高级典型 糖尿病现象。 5． 实验操作要害 1、 无菌装备 STZ 药液 2、 腹腔打针药液 3、 检测小鼠血糖 6． 留意事项 STZ 药液有毒， 留意防护 （二） 蛋白的生物学功用点评 1． 实验特色 实 验类型 ： 创 新 实 验类别 ： 专 业 方案 学时： 6 每组人数： 5 首开日 期： 2． 实验目 的与要求 给糖尿病小鼠打针制备的蛋白 调查血糖、 心跳及体温等其他生理目标的改变。 3． 首要仪器设备 序号 1 血糖仪 2 生物机能实验体系 首要仪器设备称号 类型标准 国产 数量 1 1 4． 实验内 容概要 经过不同 剂量的打针， 调查动物生理指征的改变然后点评蛋白 的生物学功用。 5． 实验操作要害 1、 多 途径给药； 2、 观测血糖及其他生理目标。 6． 留意事项 蛋白打针的途径和剂量。 现代生物技能是当时影响国民经济的四大科学支柱之一， 而以基因工程药物为中心的医药生物技能则是生物技能范畴中最为活泼、 开展最为敏捷的部分。 现在， 基因工程药物首要以蛋白多 肽类产品为主， 因为不同蛋白之间性质的不同很大， 因而针对每一个蛋白都要探索出与其相对应的纯化程序和条件， 因求取得高纯度， 高活性且低本钱的目 的蛋白。 因而蛋白纯化技能是基因工程药物商业化的要害， 目 前人才市场上对蛋白纯化提纯技能人员 需求量较大。 目 前本科教育实验中往往选用 手艺蛋白提取， 虽然本钱较低， 但与实践出产脱节， 使咱们的学生无法到达医药企业期望的制药专业毕业生应到达的水平， 降低了 我校毕业生的市场竞争力。 AKATA 蛋白 纯化系 统是目 前国 内 外生物医药公司 遍及选用 的蛋白 出产仪器， 它经过优化后的程序出产的蛋白能够直接运用 。 经过对该体系的学习 ， 学生不仅可了 解蛋白纯化的原理， 还能够直接触摸实践出产， 使咱们培育的学生更适合医药企业的需求， 进步市场竞争力。 因为 AKATA 蛋白纯化体系具有高效的蛋白别离纯化才能， 除了 满意本科生实验外， 该体系还能够处理以往手艺提纯蛋白纯度低， 不易用 于后续科研的问题。此外， 程序化的机器操作可有用屏蔽人为差错， 使成果愈加真实可信， 可有用节约人力物力， 有用进步我院科研实力。 综上所述， 咱们以为， 该体系可有用进步我院的教育质量及科研才能。 期望能够同意引 进。 榜首篇 分子克隆技能根底知识 榜首章 基因工程载体 基因工程载体是要按人们的志愿去有意图地改造， 创立生物遗传性， 因而其最根本的工程便是要得到意图基因或核酸序列的克隆。 别离或改建的基因和核酸序列本身不能繁衍， 需求载体带着它们到适宜的细胞中仿制和体现功用。对抱负的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ① 能在宿主细胞中仿制繁衍， 并且最好要有较高的自主仿制才能。 ② 简单进入宿主细胞， 并且进入功率越高越好。 ③ 简单刺进外来核酸片段， 刺进后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的仿制。 这就要求载体 DNA 上要有适宜的限制性核酸内切酶位点。 ④ 简单从宿主细胞中别离纯化出来， 这才便于重组操作。 ⑤ 有简单被辨认挑选的标志， 当其进入宿主细胞、 或带着着外来的核酸序列进入宿主细胞都能简单被辨认和别离出来。 这才介于克隆操作。 重组 DNA 技能中最常用的载体有质粒、 噬菌体 ， 柯斯质粒（cosmid） 和噬菌体 M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。 这四种载体的巨细和结构虽然各不相同， 但它们的一同特色是： ①都能在大肠杆菌中自主仿制， 并且能连同所带的外源 DNA 一同仿制； ②都很简单同细菌 DNA 分隔并加以纯化； ③都有一段 DNA 关于它们本身在细菌中的增殖不是必需的。因而， 外源 DNA 能够刺进这一段 DNA 中， 或是置换这一段 DNA 而不影响载体的仿制。 依据这一特色， 载体又可分红刺进型和置换型两大类。 榜首节 质粒载体 一、 质粒的生物学特性 质粒是指在细菌细胞内作为与宿主染色体有其他仿制子而进行仿制并且在细胞分裂时能稳定的传递给子代细...